PURIFICACIÓN DEL CBD Y OTROS CANNABINOIDES CON HPLC PREPARATIVO

Yannick Krauke, Kate Monks; applications@knauer.net KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlín; www.knauer.net

RESUMEN

La demanda de cannabidiol puro (CBD) y otros cannabinoides está aumentando y, por lo tanto, se necesitan métodos que permitan la purificación simultánea de varios cannabinoides de la misma muestra, es decir, extracto, pasta o aceite de cannabis. La cromatografía (HPLC) preparativa es un método bien establecido para la purificación de sustancias objetivo a partir de sustratos naturales en alta pureza. En esta aplicación, se desarrolló un método de cromatografía (HPLC) preparativa para la purificación de CBD, Δ9-THC y CBC a partir de un aceite comercial rico en CBD. Los tres cannabinoides se purificaron con alta pureza, aumentando así la pureza del componente principal CBD del 72% al 93%.

INTRODUCCIÓN

El cannabis sativa se utiliza en aplicaciones agrícolas y médicas desde hace ya mucho tiempo. Contiene una variedad de compuestos como terpenoides, flavonoides y cannabinoides entre los que el tetrahidrocannabinol (Δ9-THC) y el cannabidiol (CBD) son los más abundantes. El Δ9-THC es conocido por sus efectos psicoactivos y se aplica como tratamiento médico, pero es la base de estrictas regulaciones legales en la mayoría de los países. El CBD no tiene los efectos psicoactivos del THC y, por lo tanto, las legislaciones son mucho más flexibles. Dependiendo del campo de aplicación existen cepas de cannabis con alto contenido de THC y otras con bajo contenido de THC pero alto contenido de CBD. Dado que el CBD muestra efectos medicinales como el THC y se usa, es decir, para el tratamiento del dolor neuropático y las afecciones inflamatorias crónicas. Muchos productos como aceite de CBD, gotas y cosméticos también están disponibles en el mercado. La demanda de CBD de alta pureza y otros cannabinoides está aumentando, por lo que se desarrollan diferentes estrategias de purificación. Si el objetivo es purificar el CBD a partir de una muestra, en la mayoría de los casos se podría aplicar una pasta preprocesada de cáñamo rico en CBD, además de la cromatografía ultrarrápida de HPLC preparativa o cromatografía de partición centrífuga (CPC). Si el objetivo es purificar varios cannabinoides diferentes de la misma muestra, la HPLC preparativa tiene sus ventajas.

Aquí se describe la purificación de CBD, Δ9-THC y CBC (cannabichromen) a partir de un aceite de CBD utilizando un sistema HPLC preparativo KNAUER AZURA. Además, se muestra todo el proceso desde el análisis de la muestra hasta el desarrollo del método en escala analítica, hasta la escala preparativa y finalmente la purificación de los cannabinoides objetivo.

Debido a las estrictas condiciones regulatorias relacionadas con la legislación sobre nuevos alimentos en 2019, fue difícil adquirir una pasta rica en CBD u otra muestra de proceso de CBD. A modo de ejemplo, se utilizó como muestra un aceite comercial rico en CBD.

RESULTADOS

El aceite de CBD-Loges se analizó con el método de acetonitrilo descrito anteriormente. El cromatograma de aceite de CBD mostró un pico grande a tR 8,9 min y varios picos significativamente más pequeños (Fig. 1).

Fig. 1 Cromatogramas superpuestos de una muestra de aceite de CBD (azul) y una mezcla de 16 cannabinoides (rojo). Muestra de aceite de CBD 5 mg / ml; concentración estándar de 5 µg / ml cada uno; Inyección de 10 µl, 228 nm; C18P, 3 µm, 150 x 4,6 mm de DI.

La mayoría de las impurezas eluyeron en los primeros cinco minutos (Fig. 2). Una superposición de los cromatogramas de una mezcla estándar y la mezcla de 16 cannabinoides, así como una posterior comparación del tiempo de retención, llevaron a la identificación de siete cannabinoides: CBDV, CBG, CBD, CBN, Δ9-THC, CBL y CBC. Un grupo de picos de elución temprana más grande eluyó en los primeros 5 minutos, y dos picos no identificados más grandes a los 5 y 14,4 minutos aproximadamente (Fig. 2).

**Fig. 2** Vista detallada de la Fig. 1 con la mezcla estándar de 16 cannabinoides. Los picos de sustancia identificados como positivos se resaltan con * en la muestra.

Se midió una curva de calibración de cinco puntos para los siete cannabinoides y los coeficientes resultantes estaban por encima de R> 0,999 para los siete cannabinoides (Fig. 3).

**Fig. 3 Curvas de calibración y linealidad para los cannabinoides CBDV, CBG, CBD, CBN, Δ9-THC y CBL para el método analítico de ACN a 228 nm.**

La calibración se utilizó para el análisis de la muestra de aceite de CBD. El porcentaje de área se utilizó para cuantificar la pureza de los cannabinoides identificados. Los resultados muestran que el CBD es el cannabinoide más abundante en la muestra con aproximadamente un 73% (área) seguido por CBC con 5.7 (área). En el intervalo de integración, el 15,6% (área) de la muestra fueron picos no identificados, otros cannabinoides e impurezas (Tabla 1). Los porcentajes de cannabinoides calculados en 1 mg de aceite de CBD son 5,09% de CBD y 0,17% de Δ9THC, que se acercan a las indicaciones de fabricación (5,35% de CBD y <0,2% de Δ9-THC). El contenido de CBC (0,18%) y CBG (0,17%) es similar al Δ9-THC (Tabla 1).

***Tabla. 1 Composición de análisis de cannabinoides identificados en muestra de aceite de CBD (5 mg/ml). Intervalo de integración 1,5 min – 20 min; ancho global 0,1 min; umbral global 0,1 mAU.***

RESULTADOS

Después del análisis de la muestra, se desarrolló un método de purificación para el CBD con mayor pureza. Además, el Δ9-THC y el CBC deben purificarse con el mismo método para mostrar la posibilidad de purificar varios cannabinoides diferentes de una muestra en una sola ejecución. Se desarrolló un método de gradiente de metanol rápido a escala analítica con un tiempo de ejecución total de 13 minutos (Fig. 4; Tab. 5).

***Fig. 4 Muestra de aceite de CBD (5 mg/ml) con método de gradiente de metanol optimizado a 228 nm (azul) y 306 nm (rojo); C18, 3 µm, 150 x 4,6 mm de DI.***

La comparación de los cromatogramas de la muestra de aceite de CBD y seis cromatogramas estándar de cannabinoides permitió el mapeo de los mismos (Fig. 5). CBG y CBD están casi coeluyendo. Por lo tanto, el CBD purificado siempre contendrá CBG utilizando este método. Los otros cuatro cannabinoides identificados eluían cerca unos de otros, pero una separación distinta de Δ9-THC y CBC parecía prometedora (Fig. 5).La comparación de los cromatogramas de la muestra de aceite de CBD y seis cromatogramas estándar de cannabinoides permitió el mapeo de los mismos (Fig. 5). CBG y CBD están casi coeluyendo. Por lo tanto, el CBD purificado siempre contendrá CBG utilizando este método. Los otros cuatro cannabinoides identificados eluían cerca unos de otros, pero una separación distinta de Δ9-THC y CBC parecía prometedora (Fig. 5).

Fig. 5 Superposición de vista detallada de muestra de aceite de CBD y cromatogramas estándar individuales. Aceite de CBD-Loges (línea discontinua), estándares en orden de elución: CBG (5 µg/ml), CBD (10 µg/ml), CBN (10 µg/ml), Δ9-THC (10 µg/ml); CBL (5 µg/ml), CBC (5 µg/ml), C18, 3 µm, 150 x 4,6 mm DI

El método optimizado se transfirió a una columna C18 con longitud y diámetro interno similares, pero con un tamaño de partícula mayor (10 µm), que corresponde al tamaño de partícula de la columna preparativa posterior. La solubilidad máxima del aceite en metanol/agua (75%/25% v/v) fue de 50 mg/ml. Cantidades mayores no fueron solubles (datos no mostrados). En esta columna se realizó un estudio de sobrecarga de volumen con una muestra de aceite de CBD de 50 mg/ml. Los resultados mostraron que incluso con inyecciones de 15 µl, el pico de CBD tenía un comportamiento de absorción casi lineal (Fig. 6).

Fig. 6 Estudio de sobrecarga de volumen con el método de metanol en una partícula C18 de 10 µm. Inyección de 2 µl, 5 µl, 10 µl, 15 µl de 50 mg / ml de muestra de CBD-Loges; C18, 10 µm, 150 x 4,6 mm de DI.

El aumento del tamaño de partícula disminuyó ligeramente la resolución, pero todavía era adecuado para la purificación de los compuestos target. Se realizó un escalado lineal ascendente del método. El diámetro interior de la columna (DI) se aumentó de 4,6 mm a 20 mm. El caudal se incrementó de 1,2 ml/min a 23 ml/min. Los parámetros se calcularon con el KNAUER ScaleUp Converter. Se probaron diferentes volúmenes de inyección comenzando desde 200 µl hasta 2000 µl de una muestra de aceite de CBD de 50 mg/ml. De la serie de inyección de 2 ml se recogieron cinco fracciones con el objetivo de purificar CBD/CBG, Δ9-THC y CBC (Fig. 7).

**Fig. 7** Purificación preparativa de CBD. 2 ml de muestra 50 mg/ml inyección y fraccionamiento; C18, 10 µm, 150 x 20 mm de DI.

El fraccionamiento automatizado se llevó a cabo mediante el umbral de señal del software PurityChrom®. Las fracciones recogidas se analizaron y los cromatogramas se compararon con el cromatograma de la muestra de aceite de CBD inyectada. Los resultados mostraron claramente que solo se detectaron CBD, CBG y una pequeña cantidad de impurezas en la fracción 1, pero ninguno de los compuestos de elución temprana y tardía (Fig. 8).

**Fig. 8** Análisis de la fracción 1 (rojo) de la Fig. 7 y superposición con cromatograma de muestra (azul). Inyección de 10 µl; método analítico de ACN.

Mientras que en la fracción 5 está presente principalmente CBC (Fig. 9).

**Fig. 9** Análisis de la fracción 5 (rojo) de la Fig. 7 y superposición con cromatograma de muestra (azul). Inyección de 10 µl; método analítico de ACN.

Las otras fracciones no se muestran. Los porcentajes de área (indicador de pureza) de los cannabinoides probados y el porcentaje de la cantidad total se determinaron para las cinco fracciones recolectadas (Tabla 2). En la fracción 1 se recogieron todos los CBG y CBD. La pureza del CBD se incrementó de aproximadamente un 72% en el aceite de CBD al 93% en la fracción 1. Las fracciones 2 y 3 contenían una mezcla de diferentes cannabinoides pero también cantidades elevadas >65% (% de área) de compuestos no identificados. La fracción 4 contenía principalmente Δ9-THC (~ 80%) y la mayor parte de la muestra (~ 90%). La fracción 5 contenía el 100% del CBC con una pureza de aproximadamente el 97% (Tabla 2).

Tabla. 2 Análisis de fracciones de purificación preparativa (inyección de 2 ml con 50 mg/ml) de cannabinoides de muestra de aceite de CBD. Para cada área de fracción, se muestran el % de cannabinoides identificados y el % de la muestra total. Intervalo de integración 1,5 min – 20 min; ancho global 0,1 min; umbral global 0,1 mAU.

PREPARACIONES DE MUESTRAS

Para la aplicación se utilizó un aceite rico en CBD disponible comercialmente (CBD-Loges, 10 ml, con extracto de cáñamo que contiene un 5,35% de CBD). Este aceite también contenía una gran cantidad de aceite de sésamo. El aceite se diluyó en metanol hasta la concentración indicada (es decir, 5 mg/ml) y se sonicó durante 15 minutos. Después de 10 minutos de sedimentación, la solución se filtró a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 µm para eliminar la parte no polar de la mezcla. Para concentracioknes de aceite más altas (50 mg/ml) se repitió la filtración y la sedimentación. Se prepararon estándares de calibración de cannabinoides a partir de una solución estándar de cannabinoides de 1 mg/ml (Tabla 3) y se diluyeron con metanol a las concentraciones indicadas. Los estándares se prepararon en dos soluciones mixtas, mezcla 1 (CBDV, CBG, CBD, CBN) y mezcla 2 (Δ9-THC, CBL, CBC). Se estableció una curva de calibración de cinco puntos con 0,4 µg/ml, 2 µg/ml, 10 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml de cada uno de los siete cannabinoides identificados.

CONCLUSIÓN

El análisis del aceite CBD-Loges mostró que el cannabinoide principal era el CBD con una pureza del 72%. La información del fabricante de que el aceite contiene 5,35% de CBD y <0,2% de Δ9-THC podría confirmarse con los resultados del análisis (5,09% de CBD y 0,17% de Δ9-THC). Se desarrolló un método de gradiente escalonado a base de metanol preparativo para purificar CBD, Δ9-THC y CBC en alta pureza a partir del aceite de CBD. El CBD se purificó con una recuperación del 100%, lo que dio como resultado un rendimiento de 5,09 mg de CBD a partir de una inyección de aceite de 100 mg de CBD (2 ml de una solución de 50 mg/ml). Los resultados demostraron la simplicidad de un escalado lineal y las ventajas de realizar la optimización del método en escala analítica. Este enfoque ahorra tiempo, muestra y disolvente. El método mostrado es un ejemplo y estaba dirigido a tres cannabinoides. Dependiendo de los cannabinoides objetivo, el método podría adaptarse. Es importante mencionar que el rendimiento podría mejorarse significativamente utilizando una muestra con concentraciones más altas de los compuestos objetivo.

No obstante, podría utilizarse el mismo sistema de HPLC preparativa KNAUER AZURA. Además, podría ser posible cambiar el disolvente a etanol, acetonitrilo o incluso a una fase normal, pero luego el desarrollo del método debe comenzar desde el principio.

“KNAUER no respalda el uso de sus productos en relación con el uso, cultivo o comercio ilegal de productos de cannabis. KNAUER no respalda el uso ilícito de marihuana, simplemente proporcionamos una descripción general de los métodos y sistemas de análisis y purificación de cannabis.”

MATERIALES Y MÉTODOS