AISLAMIENTO PREPARATIVO DE PIPERINA A PARTIR DE EXTRACTOS DE PIMIENTA NEGRA CON CROMATOGRAFÍA HPLC AZURA Compact

• Categoría: Análisis de alimentos.
• Matriz: Extracto de pimienta.
• Método: HPLC analítica, HPLC preparativa.
• Palabras clave: Pimienta, control de calidad, control de pureza, desarrollo de métodos, columna preparativa Vertex Plus AX, AZURA Compact, AZURA Prep.
• Analitos: Piperine.
• ID: VFD0117N, 02/2013

-Resumen:

Esta nota de aplicación presenta cómo los sistemas de HPLC preparativa AZURA compact y AZURA trabajan juntos de la mano en un proceso completo de desarrollo de métodos, purificación y control de pureza de piperina a partir de extractos de pimienta negra. La aplicación de una columna preparativa Eurospher II C18 con tecnología de compresión axial conduce a un método HPLC preparativo robusto y fiable para el fraccionamiento de Piperine. La columna de carcasa de núcleo BlueShell classic C8 muestra al mismo tiempo la resolución más alta para el control de pureza posterior en un sistema HPLC clásico y económico con contrapresión moderada.

-Introducción:

La pimienta negra (piper nigrum) es una especia picante muy utilizada. Además se utiliza en la medicina tradicional (1). La piperina (Fig. 1) es el principal compuesto que conduce a la bioactividad de la pimienta blanca y negra. Su acritud se ha estimado en 100000-200000 Scoville Unit (2), (3).

La piperina es un alcaloide y es la carboxamida del ácido piperico y la piperidina. Muestra baja solubilidad en agua, pero el etanol y otros solventes orgánicos son adecuados para resolver esta sustancia. En las últimas décadas, Piperine se convirtió en el foco de la investigación farmacéutica. Tiene efectos antibacterianos (4), antioxidantes (5), antiinflamatorios (6), antiartríticos (6) y otros. El punto más interesante es que la piperina aumenta la biodisponibilidad de varios fármacos terapéuticos y fitoquímicos (7).

La concentración de piperina en la pimienta blanca y negra varía solo del 3 al 8% (8). Por lo tanto, se requiere un paso de purificación para la recuperación de piperina a partir de pimienta natural. En esta aplicación se observará la extracción con acetona de Piperina de pimienta negra, el aislamiento de este compuesto por cromatografía preparativa y además se mostrará el análisis de calidad correspondiente.

Preparación de muestras experimentales

La piperina se extrajo de Pepper usando acetona. Por lo tanto, aprox. Se pesaron exactamente 6g de pimienta negra molida en un matraz adecuado y se añadieron 50ml de acetona (p.A.) seguido de un baño ultrasónico de 30 min a 60ºC. Después de un tiempo de extracción total a 60ºC de aproximadamente 120 minutos, se sedimentó el polvo y se recogió el sobrenadante. Teniendo cuidado de que no se produzca precipitación en la muestra, se añadieron 600 µl de agua por 1ml de extracto. Después de filtrar a través de un filtro de 0.45 µm, la solución estaba lista para inyectarse en el sistema de HPLC respectivamente la purificación mediante HPLC preparativa.

El método de cribado se desarrolló con el objetivo de separar el pico Piperine objetivo de la matriz. Al mismo tiempo, el método tiene que ser robusto y económico, porque se ejecutará en el modo preparativo y consumirá mucho eluyente después del paso de escalado. La columna también tiene que ser escalable al rango de preparación. Bajo estas precauciones, se eligió una columna Eurospher II C18 con un tamaño de partícula de 5 µm y se utilizó una mezcla de agua y acetona como fase móvil durante el desarrollo del método analítico. La acetona no se usa comúnmente como eluyente en HPLC, pero debido al precio mucho más barato en comparación con el acetonitrilo o el metanol, en este caso se eligió como fase móvil. Además, es un líquido muy volátil que simplificará la recuperación de la piperina purificada de la fase móvil preparativa. El método resultante se transfirió al rango preparativo manteniendo idénticas las fases estacionaria y móvil y ampliando los parámetros del método. El factor de escalamiento es 25 para escalar desde una columna de ID de 4mm hasta una columna de ID de 20mm llena con el mismo material de columna.

Después de la purificación de piperina mediante cromatografía preparativa, se investigó la pureza de la fracción con un método de HPLC diferente. En este caso, se eligió la columna BlueShell classic C8, por su alta resolución. La tecnología de la carcasa del núcleo utilizada para estas partículas produce picos realmente agudos y, al mismo tiempo, una contrapresión tolerable. Para el control de la pureza, se utilizó acetonitrilo como fase móvil porque aquí el objetivo era obtener la resolución más alta y no el análisis más barato.

Parámetros del método Método analítico para escalar hasta HPLC preparativa

Método preparativo para la purificación de piperina.

Método analítico para el control de la pureza

Resultados

El primer análisis se realizó para seleccionar la columna de la derecha y los parámetros del método de mejor ajuste para HPLC preparativa. La figura 2 muestra el cromatograma correspondiente registrado con el método analítico optimizado. La traza azul muestra el cromatograma a 340 nm y la traza verde a 210 nm. El pico objetivo muestra la mayor abundancia a 340 nm y, por lo tanto, esta longitud de onda también se eligió en la escala preparativa. Por otro lado, la mayoría de las impurezas se detectan mejor a 210 nm. Esto se vuelve obvio desde el zoom de la línea de base. en la Fig. 2. Esta es también la razón por la que se recomienda el control de la pureza a 210 nm.

Una vez que se obtienen resultados analíticos satisfactorios, el usuario puede transferir el método fácilmente a la escala preparativa. Esto significa que los parámetros del sistema, la columna y el método deben ampliarse. Antes de la transferencia, se aumentó el volumen de inyección en el modo analítico. El cromatograma resultante con un volumen de inyección de 40 μl y con ello una sobrecarga de columna se puede ver en la figura 3.

Ahora se utilizó el sistema de HPLC preparativa AZURA y una fase Eurospher II C18 rellenada en el hardware KNAUER Vertex Plus AX con compresión axial. El cromatograma preparativo resultante se puede ver en la fig. 4. Las marcas indican cuándo se recogió la fracción de piperina para alcanzar la máxima pureza.

La fracción de piperina se recogió utilizando una válvula de conmutación. Para controlar la pureza de esta fracción, el siguiente paso fue un método de HPLC de alta resolución utilizando la columna de núcleo clásico BlueShell y el sistema compacto AZURA. Se necesita la resolución más alta en este paso, porque todas las impurezas deben separarse del pico Piperine objetivo para descubrir la pureza de la sustancia objetivo. El cromatograma del control de pureza de la fracción Piperine se puede ver en la figura 5.

Para obtener una comparación, la fig. 6 muestra la superposición de los cromatogramas medidos antes (verde) y después (azul) de la purificación por HPLC preparativa. Resulta obvio que el extracto podría purificarse en un rango alto mediante HPLC preparativa. Los tiempos de retención varían debido a que se utilizaron diferentes selectividades de columna y diferentes parámetros de método.

Se eligió la fase clásica BlueShell con una modificación C8, porque daba la mejor separación y con ello el mejor control de pureza de Piperine. Con la primera columna BlueShell classic C18 probada, todavía se eluía una impureza al mismo tiempo que Piperine. Con la modificación C8, la retención fue mucho mejor para la piperina, lo que se puede ver fácilmente en la figura 6. La piperina eluye relativamente tarde después de aproximadamente 15 minutos y se separa completamente de todas las impurezas. Como resultado, en este caso el control de pureza se realizó en una columna con diferente selectividad a la utilizada para la purificación.

Para tener una idea exacta de lo bien que funciona el paso de purificación, se puede determinar el área de pico de piperina y compararla con las áreas de pico generales de las impurezas. Para este método, la pureza resultante de Piperine fue superior al 81% con respecto al área del pico. Para este cálculo, no se consideró el pico de inyección resultante de la acetona, porque la acetona se puede evaporar fácilmente después de la purificación.

Conclusión

La línea AZURA se adapta perfectamente a todos los análisis que ocurren durante el desarrollo del método preparativo. Con AZURA compact, el usuario puede ejecutar fácilmente análisis en la escala analítica para seleccionar columnas que puedan aplicarse en la escala preparativa. A través de una escala hasta el sistema AZURA Preparative HPLC, la purificación de Piperine se puede realizar con una sola ejecución. Los elementos AZURA combinables ayudan al usuario a configurar un sistema que se adapta perfectamente a la tarea de separación individual.

Después del paso de purificación mediante HPLC preparativa y el fraccionamiento del pico objetivo, se puede realizar fácilmente un control de pureza aplicando el mismo sistema compacto AZURA que se usó antes durante el desarrollo del método. El sistema puede realizar un análisis rápido y sensible de la fracción de piperina purificada. La aplicación de una columna C8 clásica de BlueShell conduce a picos muy nítidos y, por lo tanto, a muy buena resolución y límites de detección bajos.

REFERENCIA

• Natural Standard; 2011; http://www.naturalstandard.com/news/news201102006.asp; status from 15.02.2013
• F. Tausig, JI Suzuki and RE Morse; 1956; Food Technology, Volume 10; pp. 151– 154.
• K. G. Raghuveer and Ananthakrishna, S. M.; 1980; Journal of Food Science and Technology, Volume 17; pp. 268-272
• P.V. Karsha and O.B. Lakshmi; 2010; Indian Journal of Natural Products and Resources, Volume 1; pp. 213-215
• R.S. Vijayakumar et al.; 2004; Redox Report, Volume 9; pp. 105-110
• J. S. Bang et al.; 2009; Arthritis Research & Therapy, Volume 11; pp. 1-9
• K. Srinivasan; 2007; Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Volume 47; pp. 735-748
• A. B. Wood et al.; 1988; Flavour and Fragrance Journal, Volume 3; pp. 55-64

Autores

Mareike Margraf, Columns and Applications Department, KNAUER
René Borstel, Columns and Applications Department, KNAUER
Dr. Stefan Risch, Columns and Applications Department, KNAUER
Dr. Silvia Marten, Head of Columns and Applications Department, KNAUER

Propiedades físicas de la columna de cribado analítica recomendada

Basado en un gel de sílice ultrapuro, Eurospher II es un material de columna de alto rendimiento para aplicaciones analíticas, semipreparativas y a escala de procesos. Eurospher II presenta distribuciones de tamaño de partículas y poros muy estrechas, así como una excelente estabilidad mecánica. El gel de sílice Eurospher II se adapta perfectamente a los análisis de rutina, así como a las tareas de cromatografía más ambiciosas.

Propiedades físicas de la columna preparativa recomendada

Basado en un gel de sílice ultrapuro, Eurospher II es un material de columna de alto rendimiento para aplicaciones analíticas, semipreparativas y a escala de procesos. Eurospher II presenta distribuciones de tamaño de partículas y poros muy estrechas, así como una excelente estabilidad mecánica. El gel de sílice Eurospher II se adapta perfectamente a los análisis de rutina, así como a las tareas de cromatografía más ambiciosas.

Propiedades físicas de la columna analítica recomendada para el control de la pureza

Para obtener resultados de rendimiento ultra alto sin la desventaja de una alta contrapresión, nuestras nuevas columnas clásicas BlueShell son su primera opción. Las columnas clásicas BlueShell están empaquetadas con partículas especiales de núcleo y capa de 4,5 μm, desarrolladas para proporcionar una velocidad mejorada, una resolución más alta y un consumo de eluyente reducido, todo mientras se mantienen las contrapresiones de HPLC moderadas.

Instrumentación recomendada

La línea AZURA ha sido diseñada para proporcionar soluciones HPLC altamente adaptables con características actualizadas. AZURA le ofrecerá tecnología confiable, equipo extensible y flexibilidad en su elección de aplicaciones, haciendo de los instrumentos una inversión a prueba de futuro. El sistema se puede personalizar libremente. El detector se puede elegir entre la amplia gama de detectores KNAUER. Si necesita más flexibilidad, utilice los elementos ASM 2.1L para armar su propio sistema de acuerdo con sus necesidades.

Sistema analítico: AZURA Compact

La HPLC Compact HPG consta de un elemento de bomba de gradiente de alta presión basado en ASM 2.1L con desgasificador de 2 canales integrado. El sistema se completa con un UVD 2.1L, (un detector UV / Vis con una longitud de onda variable) y viene con una bandeja de eluyente para el almacenamiento seguro de hasta 6 botellas.

Sistema preparativo: AZURA Prep

El sistema AZURA Preparative HPLC es un completo sistema preparativo de HPLC de gradiente de baja presión para la purificación de muestras de miligramos y gramos. Consiste en una bomba de HPLC preparativa con bloque de válvulas LPG, un detector UV / VIS y un módulo de combinación personalizable. La bomba P 2.1L con bloque de válvulas LPG permite formar dinámicamente mezclas de eluyentes a partir de hasta 3 eluyentes diferentes, o ejecutar un gradiente binario.

ACERCA DE KASALAB

Kasalab es una empresa comprometida con la innovación, la tecnología y la generación de valor que nació en 2014 debido a la necesidad de los laboratorios de investigación y desarrollo, de la industria manufacturera del país en los sectores de alimentos, suelos y plantas, farmacéutica y cosmética, concentrados de animales, minera, azúcar y etanol, química y petroquímica, cannabis, y ambiental, de adquirir equipos para sus laboratorios para desarrollar investigación y desarrollo de nuevos pro- ductos y tener un correcto control de calidad de sus materias primas y productos terminados en los procesos industriales y productivos acompañados de profesionales preparados y dispuestos a apoyar nuestros clientes.

Somos una organización Ambidextra que busca el balance entre la explotación de sus capacidades actuales y la exploración de nuevos negocios y mercados, trabajando continuamente por la ciencia y tecnología del país mediante el desarrollo de los tres horizontes de crecimiento, y mejoramos constantemente nuestras capacidades dinámicas de absorción, adaptación, aprendizaje e innovación para cumplir nuestro propósito superior como organización.

Hable con nosotros: por Teléfono/WhatsApp +57 300 6224380 (https://wa.link/73d9ed), correo electrónico info@kasalab.com. o por el sitio web haciendo clic aquí.

REFERENCIA